Siklopamin, esas olarak Veratrum californicum bitkisinde bulunan, Kaliforniya mısır zambağı veya sahte kardelen olarak da bilinen doğal olarak oluşan bir steroidal alkaloiddir. Özellikle embriyonik gelişim ve hücre farklılaşmasında önemli bir düzenleyici olan Hedgehog sinyal yolunu engellemede güçlü biyolojik aktiviteleriyle bilinen jervine alkaloidleri olarak bilinen bir bileşik grubunun parçasıdır.
Siklopamin, embriyonik gelişim sırasında hücre büyümesini, farklılaşmasını ve doku desenlenmesini düzenlemek için çok önemli olan Hedgehog (Hh) sinyal yolunu engelleme yeteneğiyle en iyi bilinir.
Hedgehog Sinyal Yolu: Hedgehog yolu, Hedgehog protein ligandlarının (Sonic Hedgehog, Indian Hedgehog ve Desert Hedgehog) hücre yüzeyindeki Patched (PTCH) reseptörüyle etkileşimini içerir. Hedgehog ligandlarının yokluğunda, PTCH başka bir protein olan Smoothened’ın (SMO) aktivitesini engeller. Hedgehog proteinleri PTCH’ye bağlandığında, bu inhibisyon ortadan kalkar ve SMO’nun gen ifadesini etkileyen aşağı akış sinyallemesini aktive etmesine olanak tanır.
Siklopamin Tarafından İnhibisyon: Siklopamin, SMO proteininin aktivitesine özel olarak bağlanır ve onu inhibe ederek Hedgehog sinyallemesinin iletilmesini önler. Siklopamin, bu yolu bloke ederek normal hücre büyümesini ve farklılaşma süreçlerini bozar ve bu da gelişimsel anormalliklere yol açabilir.
Gelişim Biyolojisi:
Siklopamin, gelişimsel biyoloji ve embriyogenez çalışmalarında etkili olmuştur. Hedgehog yolunu inhibe ederek, araştırmacıların nöral tüp, uzuvlar ve yüz yapıları dahil olmak üzere gelişim sırasında çeşitli yapıların oluşumunda yolun rolünü anlamalarına yardımcı olmuştur.
Kanser Araştırması:
Hedgehog sinyal yolu sadece embriyonik gelişim için değil, aynı zamanda bazı kanserlerin, özellikle bazal hücreli karsinom ve medulloblastomun büyümesinde ve sürdürülmesinde de önemli bir rol oynar. Hedgehog yolunun anormal aktivasyonu bu ve diğer kanserlerde rol oynamıştır ve bu da onu terapötik müdahale için bir hedef haline getirmiştir.
Kanser Terapötiği Olarak Siklopamin: SMO’yu inhibe etme yeteneği nedeniyle, siklopamin potansiyel bir kanser karşıtı ajan olarak incelenmiştir. Hedgehog yolunu hedef alarak tümör büyümesini inhibe etme yeteneği nedeniyle klinik öncesi çalışmalarda umut verici sonuçlar göstermiştir. Ancak, toksisitesi ve olası yan etkileri nedeniyle, siklopaminin doğrudan klinik kullanımı sınırlı kalmıştır. Bunun yerine, yapısı şu anda kanser tedavisinde kullanılan vismodegib (GDC-0449) gibi sentetik SMO inhibitörlerinin geliştirilmesi için bir şablon görevi görmüştür.
Toksisite ve Yan Etkiler:
Siklopamin oldukça teratojeniktir, yani gelişimin kritik dönemlerinde maruziyet meydana gelirse ciddi doğum kusurlarına neden olabilir. Siklopi ve diğer malformasyonları indükleme yeteneği onu güçlü bir embriyotoksik ajan yapar.
Toksisitesi nedeniyle siklopamin, özellikle hamile kadınlarda veya doğurganlık çağındaki kadınlarda insanlarda doğrudan terapötik kullanım için uygun değildir.
Keşif
1950’ler: “Maymun Suratlı” Kuzuların Gizemi
1950’lerin başı: Idaho’nun yüksek rakımlı dağ çayırlarında çobanlar, koyun sürülerinde endişe verici bir durum fark etti. Yeni doğan kuzularda ciddi kafa yüz malformasyonları görülüyordu. En dikkat çekici bulgu, alının ortasında tek bir gözün geliştiği siklopi (cyclopia) idi. Basque çobanları bu durumu “chattos” (maymun suratlı) hastalığı olarak adlandırdı. Her hasta kuzu, o dönem için yaklaşık 20 dolarlık (bugünkü değeriyle 150-300 dolar) bir ekonomik kayıp anlamına geliyordu. Çobanlar, bu malformasyonların genetik bir kusur olduğundan korkarak, sürülerinin ticari değerinin düşeceği endişesiyle sessiz kalmayı tercih etti.
1954-1955: ABD Tarım Bakanlığı (USDA), bu doğum kusurlarının nedenini araştırmak üzere görevlendirildi. İlk olarak genetik bir köken olasılığı test edildi. “Taşıyıcı” olarak kabul edilen 48 dişi koyun, 12 normal koçla çiftleştirildi. Eğer resesif bir bozukluk olsaydı, tüm kuzuların malformasyon göstermesi gerekirdi, ancak 88 kuzunun hiçbiri etkilenmedi. Bu sonuç, sorunun kalıtsal olmadığını, çevresel bir faktörden kaynaklandığını gösterdi.
1955-1957: USDA araştırmacıları Binns, James ve ekibi, etkilenen sürülerin 6.000-10.000 fit yüksekliğindeki yaylalarda, özellikle kızgınlık döneminin başında (Ağustos-eylül) otladığını belirledi. Doğum kusurlarının, kuzulama sezonunun ilk 2-3 haftasında ortaya çıkması, nedensel ajanın kısa bir süreliğine mevcut olduğunu veya fetüslerin sadece belirli bir pencerede hassas olduğunu düşündürdü. Yedi yıl süren mineral analizleri ve yerel bitkilerle besleme deneyleri sonucunda, Corydalis caseana ve Allium validium gibi bitkiler suçsuz bulundu.
1958-1960: Suçlu Bitkinin Tespiti
1958: Bir çoban, koyunların Veratrum californicum (California sahte çiğdemi / corn lily) tükettikten sonra hastalandığını gözlemledi. Bu ipucu üzerine, Zehirli Bitki Araştırma Laboratuvarı (PPRL) Logan, Utah’ta besleme deneyleri başlatıldı. Hamile koyunlara V. californicum verildiğinde, aşırı salyalanma, köpürme, kusma, yürüme bozukluğu, düzensiz kalp atışı, solunum güçlüğü, nöbetler, koma ve ölüm gibi çeşitli hastalıklar gözlendi.
1959: Yapay besleme deneyleri, V. californicum tüketen hamile koyunların siklopi kuzular doğurduğunu gösterdi. Bu, sorunun kaynağının bir bitki kaynaklı teratojen olduğunu kanıtladı.
1960: USDA, 48 hamile koyunu Muldoon Canyon’daki (Challis Ulusal Ormanı) V. californicum yoğunluğu yüksek bölgeye götürdü. Koyunlar farklı sürelerde bu bölgede otlatıldı ve ardından yonca ve çayır otlarına geçirildi. Sekiz koyun, kafa yüz anomalileri olan kuzular doğurdu. Gebelik günü ve yayla maruziyeti zamanlaması analiz edildiğinde, malformasyonların gebeliğin 8-17. günleri arasında V. californicum tüketimine bağlı olduğu belirlendi. Kurutulmuş veya yeşil V. californicum verilen 148 hamile koyunda yapay besleme deneyleri, bu bitkinin fetal gelişimi bozmak için yeterli olduğunu doğruladı. Aynı koyunlar tekrar çiftleştirilip V. californicum verilmediğinde, tamamen normal kuzular doğurdular.
Kritik bulgu:V. californicum‘un köklerinde teratojenik madde en yoğun şekilde bulunuyordu; yaprak ve gövdede daha düşük seviyeler vardı. Bitkiler olgunlaştıkça veya kuraklık/donma koşullarına maruz kaldıkça, yaprak ve gövde teratojenik aktivitesini kaybediyordu. Bu durum, doğum kusurlarının “epidemik” niteliğini açıklıyordu. Gebelik günü 14, siklopi tipi defektler için kritik maruziyet zamanı olarak saptandı; bu dönem, koyun embriyolarında nöral tüp oluşumu ve desenlenmesinin başladığı zamana denk geliyordu.
1960’lar: Teratojenik Alkaloidlerin İzolasyonu ve Siklopaminin Adlandırılması
1960’ların başı: USDA araştırmacıları Keeler ve Binns, kurutulmuş bitki materyalini benzen/amonyak ve etanol ile ekstrakte etti. Alümina kromatografisi ile fraksiyonlama yapıldı ve elde edilen alkaloid-zengin ekstraktlar gebelik günü 14’te hamile koyunlara uygulandı.
1968: Bu hayvan bazlı tarama yöntemiyle, üç yapısal olarak ilişkili teratojenik alkaloid izole edildi: siklopamin (1), jervin (2) ve siklopozin (3). Jervin daha önce Veratrum türlerinde bilinen bir steroid metaboliti idi; siklopamin ve siklopozin ise başlangıçta yapıları bilinmediği için “alkaloid V” ve “alkaloid X” olarak adlandırıldı.
1969: Siklopaminin steroid yapısı yayınlandı. Daha sonra bu bileşiğin, V. album‘dan bağımsız olarak izole edilen 11-deoksojervin ile aynı olduğu belirlendi. Siklopozin ise siklopaminin glikozid türevi olarak tanımlandı.
Adlandırma: Richard F. Keeler, bu yeni bileşiğin yapısını belirlerken, Homer’in Odysseia destanında geçen tek gözlü dev Kiklop Polyphemos mitolojisinden esinlenerek bileşiğe siklopamin adını verdi. Bu isim, bileşiğin kuzularda siklopi (tek göz) gelişimine neden olan temel teratojen olmasından kaynaklanıyordu.
1970’ler: Keeler, her test edilen koyun için gram miktarlarında bileşik gerektiğinden, daha küçük omurgalılarda teratojenik aktiviteyi araştırdı. Ruminant ve non-ruminant hayvanlar arasındaki farkları inceledi. Oral verilen siklopamin, non-ruminant türlerde asit-katalizli spirofuran halka açılmasıyla teratojenik olmayan ancak toksik türevlere dönüşüyordu; bu reaksiyon kalsiyum karbonat tamponu ile eşlik edilerek minimize edilebiliyordu. Jervin, 11-keto grubu sayesinde asite daha dirençliydi.
Türler arası farklılıklar: Hamster fetüsleri, oral siklopamin ve jervin uygulamasına kafa yüz defektleri geliştirerek yanıt verdi; sıçanlar sadece siklopamine duyarlıydı; fareler genellikle her iki teratojene de dirençliydi. Şaşırtıcı bir şekilde, siklopamin ve jervin tavuk embriyolarında bile kafa malformasyonlarına neden oldu, bu da teratojenik aktivitenin memeli dışı omurgalılarda da korunduğunu gösterdi.
1980’ler: Mekanizma Gizemi
1980’ler boyunca: Siklopamin, ders kitaplarında klasik bir teratojen olarak kanonize edilmişti, ancak etki mekanizması 30 yıl boyunca gizemini korudu. Erken spekülasyonlar, siklopaminin ve türevlerinin omurgalı gelişimi için gerekli steroid hormon reseptörlerini bozabileceği yönündeydi, ancak bu model için biyokimyasal veya genetik kanıt ortaya çıkmadı.
1990’lar: Hedgehog Yolak Keşfi ve Kopru
1996: Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi’nden Chiang ve Beachy laboratuvarı, Sonic Hedgehog (Shh) gen knockout faresini üretti. Shh fonksiyon kaybı fenotipi, Idaho çobanlarının gözlemlediği “maymun suratlı” kuzulara şaşırtıcı derecede benziyordu: Kraniyofasiyal deformiteler, siklopi, hortum benzeri burun, beyin ve omurilikte ventral hücre kaderlerinin kaybı, aksiyal iskelet, uzuv ve parmak malformasyonları.
2000: Taipale ve Beachy, siklopaminin Hedgehog (Hh) sinyal iletimini inhibe ettiğini gösterdi. Bu, siklopaminin Hh yolağının ilk spesifik inhibitörü olduğunu kanıtladı.
2000’li Yıllar: Smoothened Hedefinin Belirlenmesi ve Klinik Potansiyel
2002: Beachy laboratuvarı, siklopaminin transmembran reseptör Smoothened (SMO)‘u doğrudan antagonize ettiğini gösterdi. İki N-alkil-siklopamin prob sentezlendi: BODIPY-fluoresan türevi ve fotoafinite reagent. SMO aşırı eksprese eden hücreler BODIPY-siklopamin ile boyanabiliyor ve mikroskopi/akış sitometrisi ile görülebilirken, PA-siklopamin ile ışınlama sonrası jel elektroforezi ve otomikrografi ile SMO proteininde prob modifikasyonu tespit edilebiliyordu. Bu etkileşimler, KAAD-siklopamin ile rekabetçi olarak inhibe edilebiliyordu. Fotobağlanma çalışmaları, siklopaminin heptahelikal kıvrımı (SMO’nun transmembran bölgesi) hedef aldığını, ekstraselüler sistein-zengin domain veya sitoplazmik C-terminal kuyruk bölgesini değil, gösterdi.
2002-2010: Philip A. Beachy, siklopaminin insanlarda test edilmesi için yeterli miktarda ve uygun fiyatlı temininin gerekliliğini vurguladı. Siklopaminin düşük afinitesi, zayıf oral biyoyararlanımı ve suboptimal farmakokinetiği, klinik kullanımını engelledi. Bunun yerine, vismodegib ve sonidegib gibi sentetik SMO antagonistleri geliştirildi.
2010’lar-Günümüz: Kanser Tedavisine Uzanan Yol
2016-2024: Siklopamin, bazal hücre karsinomu (en yaygın insan kanseri), medulloblastoma (en yaygın pediatrik beyin tümörü) ve diğer malignitelerde Hh yolağının kontrolsüz aktivasyonunu hedef alan tedavilerin öncüsü oldu. V. californicum ekstraktlarının 1950’lerde karakterize edilmemiş olsaydı, vismodegib ve sonidegib 50 yıl sonra geliştirilemeyebilirdi.
Sentetik SMO antagonistleri (vismodegib, sonidegib) klinik kullanıma girer
Bu keşif hikayesi, temel bilimlerin tıbbi uygulamalara nasıl dönüştüğünün çarpıcı bir örneğidir: Idaho dağlarındaki “canavar” kuzulardan, çocukluk çağı beyin tümörlerinin tedavisine uzanan 60 yıllık bir yolculuk.
Keeler, R. F., & Binns, W. (1966). Teratogenic compounds of Veratrum californicum (Durand). VI. Cyclopamine and jervine: their teratogenic effects in rats. Teratology, 1(1), 5-10.
Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., & Beachy, P. A. (2002). Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes & Development, 16(21), 2743-2748.
Scales, S. J., & de Sauvage, F. J. (2009). Mechanisms of Hedgehog pathway activation in cancer and implications for therapy. Trends in Pharmacological Sciences, 30(6), 303-312.
Gigoux, V., Kayali, A. G., & Sutton, C. (2018). Cyclopamine: from cyclops lambs to cancer treatment. Pharmacology & Therapeutics, 185, 82-90.
